目的:建立液相色谱-串联质谱法测定人血浆中甲氨蝶呤的血药浓度并用于临床血药浓度检测。方法:以甲硝唑为内标,血浆样品经甲醇沉淀后,经LC-MS/MS分离分析。采用Waters C18柱（2.1 mm×50 mm,3.5μm）,流动相为乙腈∶水（含0.1%甲酸）（15∶85）为流动相;流速:0.2 ml·min-1,采用电喷雾离子源（ESI）,以多反应监测方式（MRM）进行正离子监测,甲氨蝶呤和甲硝唑的定量分析离子对分别为m/z 454.7/308.0、172.2/128.2。结果:甲氨蝶呤在7.603800.00ng·ml-1（r=0.9982）范围内线性良好,最低定量限为7.60 ng·ml-1,方法回收率在98%107%,日内（n=5）RSD均小于6.0%,日间（n=15）RSD均小于8.0%。结论:该方法快速简便,灵敏准确,可用于甲氨蝶呤血药浓度监测和药动学研究。