目的测定大鼠肠微粒体中细胞色素P4503A（CYP3A）的活性,并对其体外孵育条件进行优化。方法采用1′-羟基咪哒唑仑的生成量表示肠中CYP3A的活性,反相高效液相色谱法测定肠微粒体中1′-羟基咪哒唑仑的浓度,用单因素实验法对其体外孵育条件进行优化,用线性Lineweaver-Burk双倒数作图法研究肠CYP3A酶促动力学。结果1′-羟基咪哒唑仑在9.10～910.00ng.mL-1内线性关系良好;体外优化的孵育条件为10μmol.L-1咪哒唑仑、4μg肠微粒体、孵育20min;肠CYP3A酶促动力学参数Km为7.61μmol.L-1,Vmax为1.26nmol.min-1.mg-1。结论HPLC操作简便、灵敏、快速,适用于肠微粒体中1′-羟基咪哒唑仑的浓度测定,肠CYP3A孵育条件及其酶促动力学研究为研究经CYP3A代谢的药物相互作用及其他物质对CYP3A酶的影响提供理论依据。