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华中科技大学同济医学院附属同济医院
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摘要：
本发明涉及多潜能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法，该方法采用单层细胞诱导方法，利用多潜能干细胞进行诱导分化，逐步形成神经上皮细胞、脊髓神经前体细胞、脊髓GABA能中间神经元。本发明所述方法快速高效，可以得到临床级别的脊髓GABA能中间神经元。
主权项：
1.诱导性多功能干细胞诱导获得脊髓GABA能中间神经元的方法，其特征在于：它包括，步骤（1）第0天至第7天：诱导性多功能干细胞在CHIR99021、SB431542和DMH1的作用下分化得到神经上皮细胞；步骤（2）第7天至第14天：加入环巴胺和视黄酸进行持续诱导分化，得到脊髓神经前体细胞；具体过程为：Ⅱ阶段培养基配制，将24.5mL DF-12、24.5mL Neurobasal加入到50mL离心管中，后加入500μL NEAA、500μL N2、1mL B27、100μL SB431542、50μL CHIR99021、100μL DMH1、5μLRA、25μL环巴胺；铺MEF用移液枪吸取六孔板里的原培养基，DF-12洗两遍，加入Ⅱ阶段培养基，用1mL移液枪吹下克隆，按1:8的比例将细胞铺到MEF饲养层细胞上，每孔培养基加至2mL，每天半换液，直到第14天；步骤（3）第14天至第21天：经消化处理后，继续在环巴胺和视黄酸的作用下进行分化，得到脊髓GABA能中间神经元，具体过程为：Ⅲ阶段培养基配制，将24.5mL DF-12、24.5mL Neurobasal加入到50mL离心管中，后加入500μL NEAA、500μL N2、1mLB27、5μL RA、25μL环巴胺；用移液枪吸取六孔板里的原培养基，DF-12洗两遍，加入Ⅲ阶段培养基，用1mL移液枪吹下克隆，按2:1比例将细胞悬浮液移入T25培养瓶中，培养基加至10mL，每天用1mL移液枪吹打神经球，防止粘连，隔天半换液，直至第21天；以及，步骤（4）经消化处理后，将所述脊髓GABA能中间神经元进行贴壁培养使其成熟；贴壁培养时间为3~4周；所述环巴胺的摩尔浓度为5nM，所述视黄酸的摩尔浓度比为1nM。
